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一種快速高通量檢測轉錄因子活性的新方法--告別實驗室苦力

作者：admin 信息來源：達科為日期：2021年08月27日打印字體：大中小

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轉錄因子通過與DNA結合來調節基因表達，從而控制細胞分裂、代謝、凋亡和DNA修復等重要過程。因為它們可以控制改變細胞內基因表達，所以轉錄因子是研究人員非常感興趣的。研究蛋白質-DNA相互作用的科學家經常依賴于WB或電泳遷移實驗(EMSAs)，這種方法基于蛋白質-DNA復合物和非復合物DNA在非變性條件下電泳遷移的相對差異，這些實驗方法步驟較多，耗時較長，通常需要放射性標記的探針。基于此，Genie公司發布了一種基于96孔板比色法的實驗產品，在該方法中，感興趣的TF首先與包被在板底的含有蛋白結合共識序列的寡核苷酸結合，孵育識別TF抗體后，通過酶顯色方法來確定轉錄因子的活性。

比色法試劑盒與傳統的方法對比

從CHO-1細胞和經過PMA（可以誘導AP-1 TF的活性）處理的CHO-1細胞中獲取核提取物，利用傳統的凝膠遷移方法和比色法同時檢測，凝膠位移分析顯示TF-DNA復合物的形成，通過放射性標記的DNA遷移率的變化來證明，但確定經處理和未處理的提取液之間的帶強度差異是有一定困難的（圖a）。相比之下，用比色法試劑盒檢測結果可發現不同處理組之間的差異非常清晰（圖b）。

比色法試劑盒的應用

通過加入刺激劑或抑制劑來評價TF結合能力的差異是比色法試劑盒的一個特征。這個特點可以用于藥物快速高通量的篩選。不同濃度的TNF-α激活NF-κB p65，分別用200 ng/ml TNFα和50 ng/ml TNFα處理HeLa細胞30分鐘和120分鐘后，制備核提取物，然后評估NF-κB TF與其共識序列結合的相對變化。在低濃度時，TNFα使NF-κB活性增加了27倍以上，而在高濃度時，TNFα使NF-κB活性增加了50倍以上(圖a所示)。

同樣，通過測量了COS-7細胞中缺氧誘導因子-1α (HIF-1α)的激活。HIF-1α TF與腫瘤進展有關，通過泛素化途徑抑制進展的治療使其穩定。2,2-dipyridyl是一種鐵螯合劑，可防止HIF-1α泛素化。用2,2-dipyridyl處理COS-7細胞17 h后，制備核提取物，然后測定HIF-1α TF與其一致序列的結合。與未處理的細胞相比，2,2-dipyridyl處理17 h后COS-7細胞的HIF-1α TF結合DNA的能力增加了3倍以上（圖b）。